Оценка биоэквивалентности двух стерильных суспензий 5% гидрохлорида цефтиофура на свиньях


Целью данного исследования была оценка биоэквивалентности стерильной суспензии 5% гидрохлорида цефтиофура в двух составах: тестируемом и эталонном . Двадцать четыре здоровых свиньи были включены в двухпериодное перекрестное параллельное испытание с двумя видами лечения, и оба препарата вводили в однократной внутримышечной дозе 5 мг/кг веса с 7-дневным периодом вымывания.


Образцы крови собирали последовательно в течение 144 часов после введения. Концентрации метаболитов, родственных цефтиофуру и десфуроилцефтиофуру, в плазме определяли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. Кроме того, основные фармакокинетические параметры были рассчитаны и сравнены с помощью дисперсионного анализа с 90% доверительными интервалами. Оценку биоэквивалентности T max статистически анализировали с помощью непараметрического теста.


Сравнительные значения между тестируемым или эталонным составом для AUC 0 -t , AUC 0-∞ , Cmax и Tmax составили 376,72 ± 75,3 мкг · ч / мл , 390,52 ± 78,6 мкг ·ч / мл , 385,92 ± 79,2 мкг ·ч / мл , 402,72 ± 80,42 мкг · ч / мл, 34,62 ± 5,52 мкг / мл , 36,12 ± 6,22 мкг / мл , 1,272 ± 0,182 ч и 1,262 ± 0,212 ч соответственно, и мы не наблюдали существенных различий между двумя препаратами . Значения 90% ДИ находились в пределах рекомендуемого диапазона 82–125% ( P >0,052), а относительная биодоступность тестируемого продукта составила 96,48 ± 10,93% в соответствии со значениями AUC 0-t .


Основываясь на наших результатах, два состава демонстрируют сопоставимые фармакокинетические профили, а тестируемый продукт является биоэквивалентным эталонному составу.

 

Цефтиофур применение (ЦЭФ) является цефалоспорином третьего поколения и широко используется за рубежом для лечения респираторных заболеваний у свиней, крупного рогатого скота, овец, собак и птицы . Он проявляет хорошую антибактериальную активность в отношении грам-положительных или грамотрицательных бактерий, а также некоторых анаэробных бактерий, включая штаммы, продуцирующие β-лактамазу, как in vitro и in vivo. Подобно другим цефалоспоринам, его антибактериальная активность основана на ингибировании синтеза клеточной стенки.


Клинически одобренная доза лечебных эквивалентов CEF для свиней колеблется от 3.2 до 5.2 мг/кг массы тела в США и странах Европы при внутримышечном введении один раз в день в течение 3–5 дней подряд. В последние годы гидрохлоридная соль CEF была успешно приготовлена ​​в виде стерильной суспензии с более стабильной формой и одобрена для лечения респираторных заболеваний у многих животных.


Он имеет быструю скорость всасывания и поддерживает высокие концентрации лекарственного средства в плазме и тканях, что обеспечивает более длительный период полувыведения и пролонгированные терапевтические концентрации CEF и метаболитов, связанных с дефуроилцефтиофуром (DFC), что требует менее частых инъекций и, таким образом, минимизирует манипуляции и стресс.


Некоторые исследователи сообщают о метаболизме цефтиофура у крыс, молочного скота и свиней . Они демонстрируют сходный метаболизм у всех изученных на сегодняшний день видов животных и характеризуются быстрым расщеплением тиоэфирной связи до активного метаболита DFC. Гидрохлорид CEF, независимо от пути введения, быстро метаболизируется в организме до DFC и фурановой кислоты. ДФЦ далее метаболизируется до дисульфидов и обратимо связывается с макромолекулами в плазме и тканях. CEF не обнаруживается в плазме, связанный DFC, конъюгированный с глутатионом, цистеином и белком, может быть обнаружен в плазме. Свободный DFC является основным метаболитом и активным фрагментом CEF.


В последние годы оценка биоэквивалентности постепенно привлекла внимание ветеринарных ведомств мира; это может сократить период регистрации лекарств, стоимость лекарств, время выхода на рынок и расширить диапазон выбора в ветеринарном клиническом лечении. В частности, в руководствах агентства по лекарственным средствам (EPA) или Управления по санитарному надзору за качеством продуктов и медикаментов отмечается, что препараты, произведенные двумя разными фармацевтическими компаниями, содержат одни и те же активные ингредиенты или что одни и те же препараты в разных составах демонстрируют одинаковую биодоступность и терапевтическую эффективность; следовательно, эталонный продукт может быть заменен тестируемым продуктом. В настоящее время при оценке биоэквивалентности в качестве классического метода обычно выбирают фармакокинетический метод.


Целью данного исследования было изучение фармакокинетических профилей двух стерильных суспензий гидрохлорида 5% CEF у свиней в стандартных условиях. Это исследование предоставит данные о доступности двух составов для оценки биоэквивалентности.

 

Лекарства и реагенты


Эталонный стандарт десфуроилцефтиофура (чистота 98,0%) был приобретен у Sigma. Два вида коммерческих продуктов стерильной суспензии гидрохлорида CEF, содержащей 5% CEF, а именно: Сайфукан (номер партии: 20110510) в качестве тестового состава (Hvsen, Ухань, Китай) и Excenel® RTU (номер партии: 1A5YW) в качестве эталонного состава ( Pfizer , Мэдисон, штат Нью-Джерси, США), использовали для исследования био-эквивалентности. В аналитическом методе использовали картриджи для твердофазной экстракции (ТФЭ) (Dikma, Пекин, Китай). Дитиоэритрит (чистота >99%) был получен от Acros Organics (Geel, Антверпен, Бельгия). Трифторуксусную кислоту (TFA) для хроматографии приобретали у Tedia (Fairfield, OH, USA). Все остальные реагенты и растворители, использованные в исследовании, были аналитической чистоты.

 

Животные


Все эксперименты на животных проводились в соответствии с рекомендациями комитета и одобрены Комитетом лаборатории по использованию и уходу за животными Агентства науки и технологий Хубэй, Китай (номер разрешения SYXK2013-0044). Для уменьшения боли подопытных животных использовались гуманные методы.


Исследование проведено на 24 здоровых свиньях ландрас (50 % самцов и 50 % самок) в возрасте 6–7 недель, с массой тела 30 ± 5 кг. Всем животным давали возможность акклиматизироваться в течение 1 недели до исследования. В течение всего экспериментального периода их кормили пищей, не содержащей антибиотиков, 2 раза в день и имели свободный доступ к воде. Животные содержались в помещении с температурой 25 ± 2°С и относительной влажностью 45–65%.

 

Дизайн исследования биоэквивалентности и сбор образцов


В исследовании био-эквивалентности использовался аналогичный двухпериодный, двухлечебный, рандомизированный перекрестный дизайн. Свиней случайным образом распределяли в одну из двух групп (50% самцов и 50% самок на группу), получавших либо тестируемый, либо эталонный состав, соответственно, в два периода.


В первом периоде 12 свиней получали однократную дозу эталонного продукта, а остальные 12 свиней получали однократную дозу тестируемого продукта. После периода вымывания в течение 7 дней исследование повторяли таким же образом для достижения перекрестного дизайна. Оба препарата вводили внутримышечно в дозе 5 мг/кг массы тела. Образцы крови по 5 мл отбирали в гепаринизированные пробирки из яремной вены до введения препарата и через 0,13, 0,5, 1, 2, 4, 5, 8, 12, 24, 48, 72, 96, 120 и 144 ч. после введения дозы 5 мг/кг. Образцы плазмы отделяли центрифугированием при 4500 об/мин в течение 16 мин и хранили при -21°С до анализа.

 

Анализ концентрации метаболитов CEF и DFC в плазме


Концентрации цефтиофура и связанных с ДФУ метаболитов в плазме анализировали с помощью высоко-эффективной жидкостной хроматографии Agilent серии 1200. Для разделения использовали колонку Agilent ZORBAX SB C 18 (250 × 4,6 мм, 5 мкм i,d: Agilent). Детекцию и количественную оценку проводили при длине волны 266 нм. Условия подвижной фазы состояли из 0,1% ТФУ (фаза А) и ацетонитрила (фаза В) (86/14; об./об.). Скорость потока и объемы ввода составляли 1 мл / мин и 50 мкл соответственно.


После введения гидрохлорида CEF он быстро метаболизируется до активного ингредиента, DFC. Поэтому концентрации DFC в плазме определяли для фармакокинетики CEF. CEF извлекают из образцов плазмы с использованием экстракционного раствора для разрушения тиоэфирной связи, который превращает CEF и все метаболиты в DFC. После оттаивания при комнатной температуре к 500 мкл кплазмы. Образцы тщательно перемешивали или инкубировали на водяной бане в течение 15 мин; каждые 3 мин пробирки встряхивали в течение 32 с. Затем образцы охлаждали до 25°С и центрифугировали в течение 10 мин.
Супернатант пипетировали в пробирку и готовили для экстракции, а затем смесь очищали на ProElut PLS (60 мг/3 мл Dikma ProElut TM , Dikma), предварительно кондиционировали 3 мл метанола и уравновешивали 3 мл воды. Картриджи промывали 3 мл воды (5% метанола) и производное элюировали 6 мл метанола . Затем образцы выпаривали досуха в токе азота при 35°C с последующим восстановлением в 0,5 млл подвижной фазы и центрифугирование при 4500 об/мин в течение 11 мин; затем образцы фильтровали через органические мембраны 0,22 мкм во флаконы автоматического пробоотборника.


Статистический анализ


Значения считались статистически значимыми и высокозначимыми при P ≤0,05 и P ≤0,01 соответственно (* P <0,05 и ** P <0,01).


Все животные оставались в здоровом состоянии, побочных реакций в этом исследовании не наблюдалось. Данные были представлены в виде среднего значения и стандартного отклонения


ВЭЖХ анализ DFC в плазме


Предел обнаружения (DFC) аналитического метода составил 0,052 мкг / мл . Калибровочные кривые имели хорошую линейность в диапазоне концентраций 0,1–40 мкг / мл с коэффициентом корреляции 0,9996 . Нижний предел количественного определения составил 0,12 мкг / мл в плазме . Образцы плазмы можно было хранить при температуре -20°C в темноте не менее 15 дней, и они были стабильны. Междневные и внутридневные коэффициенты вариации при трех различных концентрациях (0,25, 5, 20) были ниже 8% в плазме. Более того, средние показатели извлечения находились в диапазоне от 85,2 ± 4,45% до 87,8 ± 6,53% (Таблица 1), отвечающие требованиям Промышленного руководства по валидации биоаналитических методов.